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如何選擇試劑,評價試劑是否符合自己實驗室條件?

2016-07-07 16:57

現在臨床PCR實驗室使用的試劑大部分都是各生產企業提供的商品化的試劑盒,那么試劑質量的好壞直接決定了實驗結果的好壞,而不同廠家試劑的性能、質量和價格千差萬別,如何選擇一款合適的試劑對每個PCR實驗室都至關重要,一般來說,選擇試劑主要從以下幾個方面進行評價:

1、重復性  

首先,試劑檢測結果的重復性直接展現了試劑的方法學及其質量的好壞,是評價試劑好壞最明顯、最直接的指標。  

其次,我們在此說的試劑重復性是指對原始樣本檢測的重復性,而不是對某一個樣本提取的核酸進行重復性的檢測和評價。  

最后,試劑的重復性對于療效檢測、用藥指導有著重大的意義,一個重復性好的試劑,往往能夠在病人的抗病毒治療過程中,給醫生和病人提供最直接、最可靠的數據,讓醫生和病人對疾病進展有更清楚的認識,從而制定合理的治療方案,實現更好的治療效果。

2、靈敏度  

一個試劑的靈敏度往往能夠體現該試劑的技術水平和先進程度,同時對于臨床病癥的監測有著舉足輕重的意義。以乙肝為例來說,我國的乙肝復發率遠遠大于發達國家,同時由乙肝病毒感染轉換為慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列,這很大程度上與對低載量病毒監控的嚴重不足有關。美國肝病學會專家組就提出,對乙肝抗病毒治療過程中,HBV DNA的最低監測點應設置為10IU/ml,而歐洲和亞太肝病學也指出HBV DNA病毒載量應該盡可能小于10IU/ml。這都足以證明,高靈敏度對于用藥治療、病程監控等起著巨大的作用,靈敏度越高,對于疾病的監控效果更好,對于確定治療的終點,具有積極的指導作用。

3、定量準確性  

對于臨床檢測中定量項目來說,試劑盒定量的準確性是非常重要的,也是評價定量試劑盒的一個重要指標之一。衛生部每年都會有2次全國性的室間質評,通過質評結果可以很好的看出試劑盒定量的準確性。  但往往很多時候,實驗室在選擇試劑的時候都偏重與過去的試劑盒比較定量結果的差異,并以過去的試劑盒定值作為標準來參考和評價一種新試劑,其實這種方法不完全可取。不過可以通過同時檢測衛生部的質控品來進行比較,這樣才使得兩種試劑在同一客觀標準上進行PK,得到合理公平的評價。  

同時,要驗證一個試劑的定量是否準確,我們可以采用一個高濃度樣本,用陰性血清依次進行10倍梯度的稀釋,然后選取多家試劑公司的產品進行同步檢測PK,考察各公司試劑對樣本定值的實際值與理論值的差異,即可判斷各公司試劑定量準確與否。 

4、有無內標監測  

內標的一個最主要的作用就是控制假陰性結果的發生,但在國內臨床檢測中往往被忽視了,這主要與兩個方面有關,一個是之前國內使用的很多熒光定量PCR儀均為單通道的儀器,無法進行多色熒光的檢測;國內外PCR行業對內標的研究已不是一個新興課題,目前國內PCR行業能把內標做得非常好的科研單位或商業化的PCR試劑廠家寥寥無幾,這正體現了這一技術的難度。  

在臨床檢測中,內標的作用非常重要。在臨床檢測過程中,怎么做到每一個陰性結果均為真正的陰性結果,從而杜絕因擴增抑制而出現的假陰性結果呢?內標的加入就能夠很好的防止假陰性結果了,加入我們做了一個樣本,它的目標檢測熒光為陰性,內標檢測熒光也為陰性,那么這個樣本的擴增則受到了抑制,該陰性結果為假陰性,我們必須對該樣本進行復檢。如果試劑沒有內標的話,我們則不能很好的判斷該結果是否正常?是否可以發報告?在發報告時,我們無法保證發出去的結果百分之百的準確;內標的加入,就可以解決我們這方面的煩惱。目前,衛生部的專家也在大力推崇內標的重要性,也是為了保證檢驗結果的準確可靠。

5、線性定量范圍  

試劑盒的線性定量范圍指的是試劑盒最低檢測下限和最高檢測上限之間的范圍,范圍越寬說明試劑盒性能越好。

6、UNG酶防污染體系  

PCR反應過程中, 1個拷貝的DNA經過30個循環后,可以增長到10億個拷貝的產物DNA, 極微量的PCR 產物污染,就可能造成假陽性,因而這是一個值得特別重視的問題。尿嘧啶糖苷酶(UNG)法:將PCR 產物中的dT用dU 代替。這種dU 化的PCR 產物與UNG 一起孵育,因UNG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵,可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸,從而失去被再擴增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響,UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶,而對RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。  

此外,試劑的穩定性、批間差、溯源性(是否溯源于WHO國際標準品)等也都是考察一款試劑盒質量重要指標。

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