熒光定量PCR儀的熱蓋失效或故障最主要的表現(xiàn)是：控溫不準(zhǔn)和液體揮發(fā)，反應(yīng)液揮發(fā)會最終導(dǎo)致曲線不擴增，呈斜線上升。首先可通過曲線判斷熱蓋是否故障，若確定熱蓋已經(jīng)壞了，建議可以在每個PCR反應(yīng)管中加入一層礦物油（礦物油可避免反應(yīng)液揮發(fā)），上機測試曲線結(jié)果是否正常。如曲線仍然異常，則建議請儀器工程師現(xiàn)場維修，甚至直接更換熱蓋。

　　通常我們建議在實驗室配備UPS電源，這樣能夠保證PCR儀器運行過程中的正常供電，從而保證程序的正常運行。PCR儀器在運行中突然斷電的話，如儀器有斷電保護功能，則可直接繼續(xù)運行程序。如實驗室無UPS電源，突然斷電而導(dǎo)致PCR程序不能完成，為了保證實驗結(jié)果的真實性，建議只能重復(fù)實驗再上機檢測。

要判斷自己的PCR儀器是否正常，可從以下幾方面考慮：1.    儀器開關(guān)機，與軟件連接是否正常。2.    儀器運行同樣的實驗所需要的時間是否跟平時一致，由此判斷儀器的加熱制冷模塊是否正常。3.    曲線結(jié)果是否呈明顯的S型，若曲線異常，如呈曲折上升狀，則可能是熱蓋問題，或者是熒光檢測裝置出現(xiàn)問題。4.    若曲線的熒光值與平時相比，明顯降低，則要考慮是否需要更換儀器光源（尤其是鹵素?zé)簦涔庠磯勖s2000h）。5.    若儀器某一孔或幾孔的熒光值明顯高于其他孔位，則需要考慮儀器的孔槽或檢測光路是否受到熒光污染，建議清洗儀器孔槽后再進行測試。

　　如實驗室的擴增產(chǎn)物泄露，造成實驗室的污染，那么后果將非常嚴(yán)重。要去除污染，首先最重要的是保持通風(fēng)，保證擴增產(chǎn)物片段能順利擴散出去；其次可采用稀酸處理法，對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；再次采用紫外照射法，紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大；最后若污染長時間不能消除，建議更換另外廠家的PCR試劑進行檢測，因為每個廠家的引物設(shè)計區(qū)域不一樣；一般情況下，一家試劑公司的擴增產(chǎn)物不會在另外一家廠家的引物設(shè)計區(qū)域內(nèi)，因此不會造成產(chǎn)物污染的假陽性。

1）為了保證檢測質(zhì)量，臨床PCR實驗室應(yīng)有充分合理的空間，良好的照明和空調(diào)設(shè)備。工作環(huán)境雖不是檢測質(zhì)量的直接原因，但寬敞舒適的實驗室環(huán)境將肯定有利于檢驗質(zhì)量的保證。

2）合理有效地對儀器設(shè)備進行管理，定期做維護和校準(zhǔn)，使其處于一個良好的狀態(tài)。例如，定期校準(zhǔn)移液器，使其保持足夠的準(zhǔn)確度和精密度。定期維護熒光定量PCR儀的光學(xué)系統(tǒng)和反應(yīng)孔間溫度差異，使其保持在良好狀態(tài)和允許的范圍內(nèi)。此外，還包括天平，離心機，冰箱等設(shè)備的管理。

3）理想的試劑：主要有內(nèi)外兩個因素，內(nèi)在因素包括標(biāo)本處理方法，用于核酸擴增的原材料及方法學(xué)設(shè)計等。外出因素包括試劑盒的運輸和保存中的問題。

4）標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：完整的臨床PCR程序由標(biāo)本采集，運送，保存，編號，試劑準(zhǔn)備，核酸提取，擴增和產(chǎn)物檢測，結(jié)果分析和報告等諸多環(huán)節(jié)，建立科學(xué)和與本實驗室配套的SOP文件，嚴(yán)格按SOP進行操作。

5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有標(biāo)本中的大量待測微生物，克隆質(zhì)粒，大量存在實驗室中的特定微生物以及以前擴增產(chǎn)物的殘留污染等。這些都是實驗室最容易造成假陽性的污染。因此，必須嚴(yán)格分區(qū)實驗室及遵守工作流程，使用化學(xué)清潔實驗臺面，使用紫外線照射和UNG方法消除擴增產(chǎn)物污染等等。

6）進行室內(nèi)和室間質(zhì)量控制，室內(nèi)質(zhì)量控制可以確保實驗室室內(nèi)測定質(zhì)量的一致性，室間質(zhì)量控制可以提供將實驗室測定情況與一室間和客觀標(biāo)準(zhǔn)進行回顧性比較的數(shù)據(jù)。

　　國內(nèi)外文獻報道證實，乙肝兩對半標(biāo)志物全陰性的病人不能排除HBV DNA感染，主要是因為HBV DNA的檢測窗口期出現(xiàn)早于乙肝血清標(biāo)志物，因此此類患者可能處于乙肝感染早期。 　　乙肝感染后，在乙肝“兩對半”檢測中，表面抗原HBsAg出現(xiàn)最早，一般在感染3周后出現(xiàn)，而HBV DNA的檢測能將窗口期縮短至6-15天，乙肝兩對半全陰的標(biāo)本HBV DNA為陽性，是因為病人處于感染乙肝病毒的初期，免疫學(xué)的檢測窗口期比基因檢測的窗口期長，導(dǎo)致兩對半檢測結(jié)果為陰性，由此可知：HBV DNA的檢測，對于疾病的早期診斷有著非常重要的意義。

　　HBV-DNA檢查是反應(yīng)乙肝病毒復(fù)制程度和傳染性大小的最直接指標(biāo)。臨床數(shù)據(jù)顯示，在乙肝兩對半大三陽病例  中，HBV DNA陽性的檢出率極高，但HBV DNA陰性的結(jié)果也是很有可能的。一般乙肝大三陽HBV-DNA陰性雖然表明患者病毒未超標(biāo)，但大三陽結(jié)果提示患者感染乙肝病毒，且具有較強傳染性。盡管如此，臨床檢驗者也可能遇到大三陽標(biāo)本HBV DNA檢測不出的情況。首先對于這樣的標(biāo)本，可以將標(biāo)本進行稀釋后進行復(fù)查，排除血清或血漿標(biāo)本中存在抑制物或者陽性標(biāo)本HBV DNA濃度超過試劑盒上限而導(dǎo)致PCR擴增失敗的情況。其次，乙肝病毒發(fā)生變異也是導(dǎo)致PCR擴增不出的原因之一，通常都是用藥治療患者的乙肝病毒核酸序列發(fā)生了突變。如經(jīng)過多種PCR試劑檢測失敗后，可進行DNA測序以確定乙肝病毒及其變異位點，以指導(dǎo)臨床醫(yī)生用藥治療。最后， 可更換另一廠家試劑進行檢測，排除原試劑本身設(shè)計缺陷而造成漏檢的情況。

實時熒光定量PCR擴增曲線包括基線期，指數(shù)擴增期，線性擴增期和擴增平臺期，標(biāo)準(zhǔn)的曲線應(yīng)該呈典型的S型。不規(guī)則曲線可以根據(jù)曲線的具體情況來分析：1）曲線呈斜線上升原因：熱蓋失靈或熱蓋沒蓋緊，導(dǎo)致控溫不準(zhǔn)、液體揮發(fā)。解決辦法:更換儀器熱蓋或?qū)嵘w蓋緊。圖1 曲線呈斜線上升2）擴增曲線分成兩段（斷裂）圖2擴增曲線分成兩段（斷裂）原因：基線的終點大于Ct值，通常是因為模板DNA濃度偏高，CT值< 15，而基線仍然取3-15，其中包含部分?jǐn)U增信號，導(dǎo)致曲線被壓下去。解決方法：減小基線終點，至Ct值前4個循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。3）直線擴增曲線圖3 某些樣本出現(xiàn)直線擴增曲線原因：探針部分降解解決辦法:建議更換試劑進行測試。4）曲線平臺期下掉原因：蓋子沒蓋緊解決辦法:PCR反應(yīng)管蓋子蓋上后，檢查蓋子是否蓋緊。圖4 曲線平臺期下掉